液相色譜小知識(shí)

一.做HPLC分析時(shí)，柱壓不穩(wěn)定，原因何在?如何解決?
原因可能有：
1泵內(nèi)有空氣，解決的辦法是清除泵內(nèi)空氣，對(duì)溶劑進(jìn)行脫氣處理；
2比例閥失效，更換比例閥即可。
3泵密封墊損壞，更換密封墊即可。
4溶劑中的氣泡，解決的辦法是對(duì)溶劑脫氣，必要時(shí)改變脫氣方法；
5系統(tǒng)檢漏，找出漏點(diǎn)，密封即可。
6梯度洗脫，這時(shí)壓力波動(dòng)是正常的。
二.請(qǐng)問HPLC靈敏度不夠的主要原因及解決辦法"
1樣品量不足：解決辦法為增加樣品量
2樣品未從柱子中流出：可根據(jù)樣品的化學(xué)性質(zhì)改變流動(dòng)相或柱子
3樣品與檢測(cè)器不匹配：根據(jù)樣品化學(xué)性質(zhì)調(diào)整波長或改換檢測(cè)器
4檢測(cè)器衰減太多：調(diào)整衰減即可。
5檢測(cè)器時(shí)間常數(shù)太大：解決辦法為降低時(shí)間參數(shù)
6檢測(cè)器池窗污染：解決辦法為清洗池窗。
7檢測(cè)池中有氣泡：解決辦法為排氣。
8記錄儀測(cè)壓范圍不當(dāng)：調(diào)整電壓范圍即可。
9流動(dòng)相流量不合適：調(diào)整流速即可。
10檢測(cè)器與記錄儀超出校正曲線：解決辦法為檢查記錄儀與檢測(cè)器，重作校正曲線。
三.液相色譜儀色譜柱使用及維護(hù)
每天用足夠的時(shí)間來平衡色譜柱，您就會(huì)在處理問題方面獲得zui大的"補(bǔ)償"，而且您的色譜柱的壽命也會(huì)變得更長！------ 一定得做！
　　新的色譜柱在使用之前應(yīng)該在您自己的液相色譜儀上進(jìn)行性能測(cè)試，即使用色譜柱附帶的檢驗(yàn)報(bào)告上測(cè)試條件和樣品來測(cè)定該色譜柱的柱效。并且，在以后的使用中，應(yīng)時(shí)常對(duì)色譜柱進(jìn)行測(cè)試。
　　卡套柱的安裝（不加預(yù)柱）
1．將卡套架套入柱芯
2．將兩片夾套片嵌入柱芯的凹槽，使柱芯高于夾套（見下圖）
3．將已套到柱芯上的卡套架向上推，直至高過夾套片
4．將卡套帽和卡套架旋在一起，然后用手?jǐn)Q緊
5．然后依同樣的順序連接好柱子的另一端
6．連接到液相色譜儀，PEEK接頭手?jǐn)Q即可；若為不銹鋼接頭應(yīng)使用扳手
注意：使用卡套柱時(shí)，兩端的卡套應(yīng)時(shí)刻連接在柱芯上。不管您是平衡色譜柱或是清洗，任何時(shí)候都不能將卡套取下來，否則會(huì)造成填料的流失。
卡套柱的安裝（加預(yù)柱）
1．將卡套架套入柱芯
2．將兩片夾套片嵌入柱芯的凹槽，使夾套高于柱芯（見下圖）
3．將已套到柱芯上的卡套架向上推，直至高過夾套片
4．將"子彈頭"預(yù)柱放入卡套片內(nèi)
5．將卡套帽和卡套架旋在一起，然后用手?jǐn)Q緊
6．然后依同樣的順序連接好柱子的另一端
　　平衡色譜柱 　反相色譜柱在經(jīng)過出廠測(cè)試后是保存在乙腈/水中的。請(qǐng)一定確保您所使用的流動(dòng)相和乙腈/水互溶。由于色譜柱在儲(chǔ)存或運(yùn)輸過程中可能會(huì)干掉，因此在用流動(dòng)相分析樣品之前，應(yīng)使用10－20倍柱體積的甲醇或乙腈平衡色譜柱；如果您所使用的流動(dòng)相中含有緩沖鹽，應(yīng)注意用純水"過渡"。
　　硅膠柱或極性色譜柱在經(jīng)過出廠測(cè)試后是保存在正庚烷中的。如果該色譜柱需要使用含水的流動(dòng)相，請(qǐng)?jiān)谑褂昧鲃?dòng)相之前用乙醇或異丙醇平衡
　　如何平衡色譜柱？
　　平衡過程中，將流速緩慢地提高
　　用流動(dòng)相平衡色譜柱直到獲得穩(wěn)定的基線（緩沖鹽或離子對(duì)試劑度如果較低，則需要較長的時(shí)間來平衡）
　　色譜柱的再生 　　進(jìn)行色譜柱再生時(shí)，應(yīng)使用一個(gè)謙價(jià)的泵，我們建議不使用您的液相色譜儀上的泵。
　　 表1　建議用來沖洗的溶劑體積
　　 注意：
　　 在對(duì)NH2改性的色譜柱進(jìn)行再生時(shí)，由于NH2可能成銨根離子的形式存在，因此應(yīng)該在水洗后用0.1M的氨水沖洗，然后再用水沖洗至堿溶液*流出。
　　 **如果簡單的有機(jī)溶劑/水的處理不能夠*洗去硅膠表面吸附的雜質(zhì)，用0.05M稀硫酸沖洗非常有效。
　　 色譜柱的維護(hù)
　　 1．使用預(yù)柱保護(hù)分析柱（硅膠在極性流動(dòng)相/離子性流動(dòng)相中有一定的溶解度）
　　 2．大多數(shù)反相色譜柱的pH穩(wěn)定范圍是2－7.5，盡量不超過該色譜柱的pH范圍
　　 3．避免流動(dòng)相組成及極性的劇烈變化
　　 4．流動(dòng)相使用前必須經(jīng)脫氣和過濾處理
　　 5．如果使用極性或離子性的緩沖溶液作流動(dòng)相，應(yīng)在實(shí)驗(yàn)完畢柱子沖洗干凈，并保存大乙腈中
　　 6．壓力升高是需要更換預(yù)柱的信號(hào)
每天用足夠的時(shí)間來平衡色譜柱，您就會(huì)在處理問題方面獲得zui大的"補(bǔ)償"，而且您的色譜柱的壽命也會(huì)變得更長！------ 一定得做！
　　新的色譜柱在使用之前應(yīng)該在您自己的液相色譜儀上進(jìn)行性能測(cè)試，即使用色譜柱附帶的檢驗(yàn)報(bào)告上測(cè)試條件和樣品來測(cè)定該色譜柱的柱效。并且，在以后的使用中，應(yīng)時(shí)常對(duì)色譜柱進(jìn)行測(cè)試。
　　卡套柱的安裝（不加預(yù)柱）
1．將卡套架套入柱芯
2．將兩片夾套片嵌入柱芯的凹槽，使柱芯高于夾套（見下圖）
3．將已套到柱芯上的卡套架向上推，直至高過夾套片
4．將卡套帽和卡套架旋在一起，然后用手?jǐn)Q緊
5．然后依同樣的順序連接好柱子的另一端
6．連接到液相色譜儀，PEEK接頭手?jǐn)Q即可；若為不銹鋼接頭應(yīng)使用扳手
注意：使用卡套柱時(shí)，兩端的卡套應(yīng)時(shí)刻連接在柱芯上。不管您是平衡色譜柱或是清洗，任何時(shí)候都不能將卡套取下來，否則會(huì)造成填料的流失。
卡套柱的安裝（加預(yù)柱）
1．將卡套架套入柱芯
2．將兩片夾套片嵌入柱芯的凹槽，使夾套高于柱芯（見下圖）
3．將已套到柱芯上的卡套架向上推，直至高過夾套片
4．將"子彈頭"預(yù)柱放入卡套片內(nèi)
5．將卡套帽和卡套架旋在一起，然后用手?jǐn)Q緊
6．然后依同樣的順序連接好柱子的另一端
　　平衡色譜柱 　反相色譜柱在經(jīng)過出廠測(cè)試后是保存在乙腈/水中的。請(qǐng)一定確保您所使用的流動(dòng)相和乙腈/水互溶。由于色譜柱在儲(chǔ)存或運(yùn)輸過程中可能會(huì)干掉，因此在用流動(dòng)相分析樣品之前，應(yīng)使用10－20倍柱體積的甲醇或乙腈平衡色譜柱；如果您所使用的流動(dòng)相中含有緩沖鹽，應(yīng)注意用純水"過渡"。
　　硅膠柱或極性色譜柱在經(jīng)過出廠測(cè)試后是保存在正庚烷中的。如果該色譜柱需要使用含水的流動(dòng)相，請(qǐng)?jiān)谑褂昧鲃?dòng)相之前用乙醇或異丙醇平衡
　　如何平衡色譜柱？
　　平衡過程中，將流速緩慢地提高
　　用流動(dòng)相平衡色譜柱直到獲得穩(wěn)定的基線（緩沖鹽或離子對(duì)試劑度如果較低，則需要較長的時(shí)間來平衡）
　　色譜柱的再生 　　進(jìn)行色譜柱再生時(shí)，應(yīng)使用一個(gè)謙價(jià)的泵，我們建議不使用您的液相色譜儀上的泵。
　　 表1　建議用來沖洗的溶劑體積
　　 注意：
　　 在對(duì)NH2改性的色譜柱進(jìn)行再生時(shí)，由于NH2可能成銨根離子的形式存在，因此應(yīng)該在水洗后用0.1M的氨水沖洗，然后再用水沖洗至堿溶液*流出。
　　 **如果簡單的有機(jī)溶劑/水的處理不能夠*洗去硅膠表面吸附的雜質(zhì)，用0.05M稀硫酸沖洗非常有效。
　　 色譜柱的維護(hù)
　　 1．使用預(yù)柱保護(hù)分析柱（硅膠在極性流動(dòng)相/離子性流動(dòng)相中有一定的溶解度）
　　 2．大多數(shù)反相色譜柱的pH穩(wěn)定范圍是2－7.5，盡量不超過該色譜柱的pH范圍
　　 3．避免流動(dòng)相組成及極性的劇烈變化
　　 4．流動(dòng)相使用前必須經(jīng)脫氣和過濾處理
　　 5．如果使用極性或離子性的緩沖溶液作流動(dòng)相，應(yīng)在實(shí)驗(yàn)完畢柱子沖洗干凈，并保存大乙腈中
　　 6．壓力升高是需要更換預(yù)柱的信號(hào)
四.用HPLC進(jìn)行分析時(shí)保留時(shí)間有時(shí)發(fā)生漂移，有時(shí)發(fā)生快速變化，原因何在?如何解決?
關(guān)于漂移問題：
1溫度控制不好，解決方法是采用恒溫裝置，保持柱溫恒定
2流動(dòng)相發(fā)生變化，解決辦法是防止流動(dòng)相發(fā)生蒸發(fā)、反應(yīng)等
3柱子未平衡好，需對(duì)柱子進(jìn)行更長時(shí)間的平衡
關(guān)于快速變化問題
1流速發(fā)生變化，解決辦法是重新設(shè)定流速，使之保持穩(wěn)定
2泵中有氣泡，可通過排氣等操作將氣泡趕出。
3流動(dòng)相不合適，解決辦法為改換流動(dòng)相或使流動(dòng)相在控制室內(nèi)進(jìn)行適當(dāng)混合
五.C18柱出什么問題了?買了一根 Kromasil 100－5C18柱，剛開始用時(shí)效果較好，條件為30mM KH 2 PO 4 ，pH=2.00，柱溫30度。連續(xù)使用大約兩天后，各標(biāo)準(zhǔn)品峰明顯前移。有些原來能分開的峰，現(xiàn)在用同樣的條件已經(jīng)分不開了。zui近我繼續(xù)使用該柱，不同的是每天連續(xù)使用時(shí)間不超過12小時(shí)。使用后先用5%甲醇/水沖洗，再用100%甲醇沖洗。這樣使用了三天，峰的保留時(shí)間不再前移。因此，我有二個(gè)問題： A 峰的前移是由于C18被水解的緣故嗎？如不是，又是什么原因呢？ B 對(duì)于使用低pH純水系緩沖鹽的C18柱，每天使用12小時(shí)，用5%甲醇/水洗凈緩沖鹽，再用甲醇沖洗，能延長C18柱的使用壽命嗎？
使用Kromasil 100－5C18出現(xiàn)這種情況是不了解這種柱子的特性。關(guān)于上面的二個(gè)問題，作如下分析：
1.峰前移的原因是使用了純水流動(dòng)相的緣故。kromasil填料以高碳覆蓋量而自豪，在純水（或水比例大于95%）的環(huán)境下因?yàn)镃18官能團(tuán)非極性排斥，會(huì)使伸展?fàn)顟B(tài)的官能團(tuán)在排斥力的作用下“倒伏”，同時(shí)也因極性力形成的張力使“水膜”在填料微孔口形成而覆蓋微孔口，這兩點(diǎn)都使分析物難以與C18官能團(tuán)接觸，保留時(shí)間因此提前。情況下，甚至喪失保留性質(zhì)。不僅是C18，對(duì)于Kromasil的其他填料，都反對(duì)用純水（或水比例大于95%）的流動(dòng)相。
2.其后提到“zui近我繼續(xù)使用該柱，不同的是每天連續(xù)使用時(shí)間不超過12小時(shí)。使用后先用5%甲醇/水沖洗，再用100%甲醇沖洗。這樣使用了三天，峰的保留時(shí)間不再前移。”，這正是采用了正確的方法。用甲醇或乙腈等純?nèi)軇_洗較長時(shí)間，可以使“倒伏”的官能團(tuán)回復(fù)其原有狀態(tài)，之前用5%甲醇水溶液洗去鹽再用純甲醇是非常地道的做法！
3.一般不提倡你所提到的純水使用環(huán)境。非要這樣用，我也建議你用預(yù)柱，縮短這樣的使用 時(shí)間，及時(shí)沖洗，隔夜封存于純有機(jī)溶劑都是很好的柱維護(hù)措施。
另外可考慮是否可在流動(dòng)相中添加 5%的甲醇或乙腈，如不影響分離情況和峰形的話。 其它類型的C18也有這種現(xiàn)象，只是沒有Kromasil柱明顯，為了克服純水溶劑長時(shí)間運(yùn)行產(chǎn)生“水性坍塌”對(duì)色譜柱分離造成的影響，現(xiàn)在有新型的色譜柱可以在100％水相中穩(wěn)定。
六.走空白梯度，在 11-13min出現(xiàn)未知的異常峰，并且峰值還挺大，有機(jī)相從0%-100%，這是為什么？
一般走空白梯度是不進(jìn)樣的，大多數(shù)情況這些異常峰是流動(dòng)相本身造成的。在等度洗脫的情況下，流動(dòng)相的少量雜質(zhì)一般不會(huì)影響基線和噪音，這些雜質(zhì)要么不出來，要么不間斷出來，不會(huì)產(chǎn)生異常峰（鬼峰）。對(duì)于梯度洗脫，水相或有機(jī)相中的強(qiáng)保留雜質(zhì)在開始洗脫時(shí)，由于有機(jī)相的比例低，在柱子上保留而不洗脫，但當(dāng)流動(dòng)相中有機(jī)相比例不斷加大，在色譜柱中吸附濃縮的雜質(zhì)開始被洗脫，從而在某些位置出現(xiàn)異常峰（鬼峰）。還有，如果梯度設(shè)置不當(dāng)，流動(dòng)相比例變化太快，紫外波長較低時(shí)也容易出現(xiàn)異常峰。另外需要注意的是，如果梯度泵的比例閥有問題或流動(dòng)相混合器效果不好或有少量的氣泡存在，也會(huì)出現(xiàn)這種現(xiàn)象。因此，對(duì)于梯度洗脫，大多數(shù)原因在流動(dòng)相，所以流動(dòng)相的純度非常關(guān)鍵，尤其是水的純度以及添加的流動(dòng)相改性劑的純度。
七.我zui近更換了另一種牌號(hào)的ODS柱，雖然分離情況仍可以，但保留時(shí)間不能重現(xiàn)，為什么?
這是因?yàn)楸环治鑫锟赡芫哂行纬蓺浣〉哪芰?。盡管過去幾年來，填料的制造技術(shù)有了極大的提高，但不同的廠商的ODS填料表面硅醇基的濃度不同。正是這些硅醇基可能與樣品發(fā)生相互作用。因此，同一被分析物中的各組分在不同牌號(hào)的ODS柱上的相對(duì)保留時(shí)間就可能不同。在流動(dòng)相中加入少量競爭物，如三乙基胺（TEA），將會(huì)使硅醇基的成鍵能力飽和，從而保證不同牌號(hào)柱子上的相對(duì)保留時(shí)間具有較好的重現(xiàn)性。
現(xiàn) 象 主要原因 措 施

A 輸液不穩(wěn)定 泵的脈流大
1。泵頭內(nèi)進(jìn)入氣泡。
●按pump ，驅(qū)出氣泡。
●排液管連接口連接注射器抽出氣泡。

2。泵頭內(nèi)存有以前的流動(dòng)相。
●按 pump ，將舊流動(dòng)相*清洗出去。

3．吸濾器的管內(nèi)進(jìn)入氣泡。
●按 pump ，將舊流動(dòng)相*清洗出去。
●震動(dòng)吸濾器，驅(qū)出氣泡。
●吸濾器網(wǎng)眼堵塞時(shí)，用超聲濾清洗。超聲濾清洗無效時(shí)，需更換。（檢查吸濾器網(wǎng)眼堵塞的方法 取出過濾部分，記錄壓力波形。 如果取出后壓力波形不正常，則吸濾器網(wǎng)眼堵塞。 ）
●對(duì)流動(dòng)相脫氣。

4。單向閥工作不正常
●輸送異丙醇，清洗單向閥。
●清洗無效時(shí)，用超聲波清洗單向閥，或更換單向閥.

5．泵頭與泵頭座之間的縫隙，或清洗液出口漏液
●更換柱塞密封圈。
●更換柱塞密封圈后仍漏液時(shí)，更換柱塞。

6．流路的連接處漏液
●用力擰緊公螺母。
●擰緊后仍漏液時(shí)，更換公螺母和箍環(huán)。

7．流路堵塞，或?qū)⒁氯?
●管道過濾器用超聲波清洗，或更換過濾器。
●找出堵塞的部件，更換新部件。

8。柱塞密封圈的使用壽命將到極限。
●更換柱塞。

B 流量比設(shè)定值小
1．單向閥工作不正常。
●輸送異丙醇，清洗單向閥
●清洗后仍無效時(shí)，用超聲波清洗單向閥，或更換單向閥。

2．吸濾器網(wǎng)眼堵塞。（*2）
●用超聲波清洗吸濾器。超聲波清
C 洗無效時(shí)，更換吸濾器。 保留時(shí)間的再現(xiàn)性不良
1．單向閥工作不正常。
●清洗仍無效時(shí)，更換單向閥，或用超聲波清洗。

D 高壓梯度時(shí)2臺(tái)輸液泵的壓力表示不一致
（相差在±0．5MPa（5kSf／cm2）或±2％以內(nèi)屬于正常）
1．壓力傳感器的零點(diǎn)未對(duì)準(zhǔn)。
●用輔助功能"ZER。 ADJ"，調(diào)整零點(diǎn)

2。其中1臺(tái)輸液泵的管道過濾器網(wǎng)眼堵塞。
●用超聲波清洗管道過濾器，或更換管道過濾器。

3。2臺(tái)輸液泵的流路合流之前，流路有堵塞的地方
●找出堵塞的部件，更換部件。

E 壓力上不去
1．排液閥開著
●關(guān)閉排液閥。

2。流路連接處漏液
●擰緊公螺母。
●擰緊后仍無效時(shí)，更換公螺母和箍環(huán)。

F 壓力上升過高（取下柱確認(rèn)）
1．管道過濾器堵塞。
●管道過濾器用超聲波清洗，或更換

2．流路堵塞。
●找出堵塞的部件，更換。

3．配管的內(nèi)徑過細(xì)
●使用的管子。
液相色譜柱的管理
摘 要:介紹了影響色譜柱使用壽命的幾個(gè)因素,探討了色譜柱規(guī)范化管理和保養(yǎng)的經(jīng)驗(yàn)。
關(guān)鍵詞:液相色譜;柱;管理;保養(yǎng)
液相色譜法是20世紀(jì)70年代急劇發(fā)展起來的一項(xiàng)、快速的分離、分析技術(shù)。液相色譜法是指流動(dòng)相為液相的色譜技術(shù),在經(jīng)典的液相色譜法基礎(chǔ)上,引入氣相色譜法理論,在技術(shù)上采用高壓泵、固定相和高靈敏度檢測(cè)器,實(shí)現(xiàn)了分析速度快、分析效率高和操作自動(dòng)化,它具有高壓、高速、、高靈敏度等特點(diǎn)。它是用高壓輸液泵將具有不同極性的單一溶劑或不同比例的混合溶劑,緩沖液等流動(dòng)相泵入裝有固定相的色譜柱,經(jīng)進(jìn)樣閥注入供試品,由流動(dòng)相帶入柱內(nèi),在柱內(nèi)各成分被分離后依次進(jìn)入檢測(cè)器,色譜信號(hào)由記錄儀、積分儀或色譜工作站記錄。
色譜柱是液相色譜的心臟,在液相色譜儀的使用中,保持色譜柱的柱效、容量和滲透特性,延長柱子的使用壽命非常重要。色譜柱使用時(shí)間后就會(huì)出現(xiàn)柱壓升高、柱效降低、峰形畸變和分離度降低、保留時(shí)間改變等變化,如不采取措施,將會(huì)縮短色譜柱的使用壽命,影響工作效率,并造成一定的經(jīng)濟(jì)損失。因此,有必要加強(qiáng)和規(guī)范色譜柱的管理,從而延長
色譜柱的使用壽命。本文從影響色譜柱使用壽命的幾個(gè)因素出發(fā),從管理的角度,探討色譜柱的維護(hù)與保養(yǎng)。
1 色譜柱的類型
常用的色譜柱填充劑有硅膠和化學(xué)鍵合硅膠、離子交換樹脂、凝膠或玻璃微球等填充劑。在化學(xué)鍵合硅膠中以十六烷基硅烷鍵合硅膠zui常用,辛基硅烷鍵合硅膠次之,氰基或氨基鍵合硅膠也有使用。近年來,由于蛋白質(zhì)等生物大分子物質(zhì)分離提純技術(shù)的飛速發(fā)展,離子交換色譜柱、凝膠色譜柱的應(yīng)用也越來越廣。
2 影響色譜柱使用壽命的因素
2.1 流動(dòng)相
在以水溶液為流動(dòng)相時(shí),水溶液中的微生物例如細(xì)菌容易生長,當(dāng)用水溶液或有機(jī)酸緩沖液保護(hù)柱子時(shí),一些霉菌可能在色譜柱中滋生,堵塞固定相顆粒間的空隙。由于濕法填充技術(shù)的問世,目前普遍使用的色譜柱填料直徑一般都小于10um,流動(dòng)相中的顆粒雜質(zhì)很容易先沉積在柱頭然后慢慢堵塞柱子。流動(dòng)相的pH值對(duì)色譜柱也有影響,特別是對(duì)化學(xué)鍵合硅膠填料,水溶液的pHzui適范圍在2~7.5之間,當(dāng)pH>8時(shí),硅膠會(huì)釋出生成絮狀物堵塞柱子,且難以復(fù)原,柱效很快降低,甚至*失效。當(dāng)在緩沖液中加入有機(jī)溶劑例如甲醇或乙腈時(shí),鹽類的溶解度下降,會(huì)析出鹽沉淀,堵塞柱子。同時(shí)流動(dòng)相中的有機(jī)溶劑和鹽會(huì)腐蝕色譜柱頭的篩板,產(chǎn)生柱頭凹陷。流動(dòng)相的極性對(duì)柱子也有一定影響,對(duì)于硅膠柱,甲醇、水、冰乙酸等極性較大物質(zhì)會(huì)破壞填料,反之,對(duì)于化學(xué)鍵合硅膠,極性小的物質(zhì)如正丁醇、二氯甲烷等也起同樣的作用。堿性溶液會(huì)破壞陽離子交換樹脂色譜柱,而酸性溶液容易損壞陰離子交換樹脂柱。
2.2 樣品和固定相
如果有少量或微量的樣品不能夠溶解在流動(dòng)相中,在通過固定相會(huì)堵塞柱子。樣品中的顆粒雜質(zhì)也會(huì)堵塞柱子。樣品組分例如糖、蛋白質(zhì)等通過柱子時(shí)會(huì)產(chǎn)生不可逆吸附,這樣固定相的活性點(diǎn)被覆蓋。樣品組分還會(huì)與固定相產(chǎn)生反應(yīng),尤其是對(duì)于氨基柱的影響較為嚴(yán)重,因?yàn)榘被着c酐、酮形成希夫（Schiff）縮合而減少活性點(diǎn),使保留時(shí)間縮短。色譜柱鍵合相基團(tuán)脫落、固定相分解和活性基團(tuán)變性以及會(huì)影響柱效和保留時(shí)間的顯著改變。大多數(shù)鍵合相都是通過硅氧硅鍵（Si-O-Si）連接在硅基質(zhì)上,形成帶有有機(jī)基團(tuán)的固定相Si-O-Si-R（R為CnH2n+1）,硅氧硅鍵可能在水溶液中水解而斷裂,使鍵合基團(tuán)脫落。
3 液相色譜柱的管理
3.1 色譜柱的管理
制定色譜柱管理的標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程并嚴(yán)格執(zhí)行。每一根新購進(jìn)的色譜柱必須造冊(cè)登記,內(nèi)容包括:生產(chǎn)公司、品名、型號(hào)、規(guī)格、購進(jìn)時(shí)間、啟用時(shí)間、單價(jià)、柱內(nèi)保護(hù)溶液等。色譜柱分類存放,硅膠柱、化學(xué)鍵合硅膠柱、氰基或氨基柱、離子交換樹脂柱、凝膠柱各用一個(gè)色譜柱盒,盒上貼上標(biāo)簽,注明類別。隨柱說明書裝入密實(shí)袋附在登記本上。每啟用一根色譜柱,在色譜柱上貼上標(biāo)簽,注明啟用日期。每根柱子每兩個(gè)月保養(yǎng)一次,特別是對(duì)于一些使用頻率少的柱子,因?yàn)榉胖脮r(shí)間長,容易干柱,每一次做好保養(yǎng)記錄。對(duì)于確已失效的柱子,做好停用記錄,不能隨意丟棄,專門存放,如果現(xiàn)用的柱子的填料需要填補(bǔ),可以用存放的柱子的填料。在從事生產(chǎn)的單位的質(zhì)檢部門,對(duì)于使用時(shí)間較長柱效降低的柱子,可把它用于檢測(cè)產(chǎn)品的中間體。
3.2 色譜柱的保養(yǎng)
色譜柱使用一段時(shí)間后,常遇到柱子被污染,柱效會(huì)有一定程度的下降,采用適當(dāng)?shù)姆椒▽?duì)色譜柱進(jìn)行保護(hù),可以延長色譜柱的使用壽命。
樣品和流動(dòng)相的處理:溶解的樣品進(jìn)樣前用濾膜過濾,以除去不溶物。如果必要,需進(jìn)行樣品的預(yù)處理。流動(dòng)相中如有不純物質(zhì)將影響柱效,所以溶劑盡量使用色譜級(jí)別的,至少是分析純級(jí)別,流動(dòng)相使用前用微孔薄膜過濾。在流動(dòng)相的輸液管前安裝過濾器。過濾器定期用甲醇超聲清洗,如果效果不好,可用10%的稀硝酸浸泡清洗。對(duì)于堵塞嚴(yán)重的過濾器,可在火焰上灼燒后再清洗。
保護(hù)柱（預(yù)柱）的使用:對(duì)于較昂貴的色譜柱,可以在柱前加一保護(hù)柱,防止樣品中雜質(zhì)污染分析柱,對(duì)于制備柱,因其進(jìn)樣量大,使用保護(hù)柱尤為重要。
常規(guī)處理:硅膠、氧化鋁、極性鍵合相色譜柱每一次用完后用低流速長時(shí)間的二氯甲烷或正己烷等溶劑沖洗;鍵合相硅膠色譜柱、離子交換色譜柱和凝膠色譜柱先用蒸餾水沖洗,再用甲醇沖洗,然后用甲醇與蒸餾水以一定比例混合的溶液沖洗后過夜。
對(duì)于已使用一段時(shí)間后柱效下降的色譜柱可按以下方法進(jìn)行再生。再生處理包括活化（右→左）和凈化（左→右）兩種。硅膠、氧化鋁、極性鍵合相色譜柱按下列順序沖洗:*基戊烷或己烷←→三氯乙烷←→乙酸乙脂←→丙酮←→乙醇←→水。鍵合相硅膠柱:蒸餾水←→甲醇（沖洗過程中可加入少量二甲基甲酰胺）。離子交換樹脂柱:高濃度的NaCl溶液（1-2molL的NaCl溶液）可使大部分樹脂再生,油脂等少數(shù)與樹脂緊密結(jié)合的物質(zhì)可用低濃度堿溶液（如0.1molL的NaOH溶液）沖洗,酸性有機(jī)物吸附在固定相的用低pH緩沖液沖洗,堿性有機(jī)物用高pH緩沖液沖洗,然后再用蒸餾水←→甲醇←→二氯甲烷←→甲醇←→蒸餾水沖洗。凝膠色譜柱:由于凝膠色譜柱是根據(jù)被分離物質(zhì)的分子量大小而分離物質(zhì),通常用稀的氫氧化鈉或非離子型去垢劑（0.2%-1%NP-40或Lubrol）沖洗可除去大部分的結(jié)合物質(zhì),如果一些污染物仍然不能清除時(shí),用24%或30%乙腈沖洗過夜可除去疏水蛋白,用30%-50%乙酸可除去親水蛋白,用蛋白水解酶處理可分解凝膠中剩余的痕量胃蛋白酶,然后再用蒸餾水←→甲醇←→蒸餾水沖洗。
已污染的色譜柱的處理:因保留強(qiáng)的物質(zhì)污染,流動(dòng)相或樣品中不溶物沉積于柱頭,可用下列方法洗滌:去除脂類可用四氫呋喃、乙腈或甲醇洗滌;去除蛋白質(zhì)可用乙腈、丙醇和1%三氯乙酸進(jìn)行梯度洗脫;一些高疏水性化合物可用乙腈或甲醇洗脫,同時(shí)反復(fù)注入100-200ml的四氫呋喃。
柱頭處理:對(duì)于柱頭堵塞污染嚴(yán)重的情況而且用溶劑沖洗無效的色譜柱,只有打開柱子去除柱頂?shù)奶盍现匮b:先拆下不銹鋼燒結(jié)過濾器,檢查柱床,常見凹陷或受污染的帶色填料,剔去不規(guī)則床層和帶色填料,使柱床顯白色并*水平,再用甲醇作糊狀填料勻漿液,將糊狀填料勻漿液滴在柱上靠重力從勻漿液中排出甲醇液,重復(fù)直到填料水平。
柱子的貯存:首先柱子必須清洗干凈后才能貯存,柱子不能貯存在水或水性溶劑中,否則會(huì)引起微生物的滋生。極性色譜柱可用適當(dāng)溶劑如二氯甲烷沖洗;鍵合相色譜柱用甲醇沖洗;陰離子交換色譜柱用0.002%洗必泰（雙氯苯雙胍己烷）的緩沖液沖洗,陽離子交換色譜柱用0.005%硫柳汞緩沖液沖洗;凝膠色譜柱用緩沖液中加0.02%*或用20%乙醇沖洗。再將柱子兩頭密封,以防止溶劑蒸發(fā)使柱子干燥而引起柱子結(jié)構(gòu)的幾何學(xué)改變。
液相色譜柱的保護(hù)
王 新
摘 要:本文討論流動(dòng)相及樣品對(duì)液相色譜柱的損害因素,探討液相色譜柱的保護(hù)方法。
關(guān)鍵詞:色譜柱;損害;液相色譜法
在液相色譜儀的使用中,保持液相色譜柱的柱效、容量和滲透特性,延長柱子的使用壽命非常重要。色譜柱用久后常出現(xiàn)柱壓升高,柱效降低,峰形畸變,保留時(shí)間改變等變化,如不采取適當(dāng)措施,色譜柱將無法再使用,縮短色譜柱的使用壽命,本文從影響色譜柱的外界因素出發(fā),并考慮色譜柱固定相性質(zhì)的變化,討論流動(dòng)相和樣品對(duì)色譜柱造成損害的因素,探討保護(hù)方法。
1 流動(dòng)相對(duì)色譜柱的損害因素
顆粒雜質(zhì):目前廣泛使用的柱填料直徑多在10um以下,微小的顆粒雜質(zhì)很容易使柱子發(fā)生堵塞,因此使用的溶劑應(yīng)當(dāng)過濾,柱子上端接頭應(yīng)當(dāng)裝微孔過濾片以阻擋顆粒物進(jìn)入柱中。
水溶液中的微生物:以水溶液為流動(dòng)相時(shí),應(yīng)防止細(xì)菌的生長,五氯酚、*、辛酸等能防止細(xì)菌生長。當(dāng)用水溶液或有機(jī)酸緩沖液保護(hù)柱子時(shí),一些厭氧霉菌可能在色譜柱中滋生,堵塞固定相顆粒間的空隙。
pH值:對(duì)硅膠基鍵合相填料,水溶液pH值不可超過2-7.5這一范圍,當(dāng)pH>8時(shí),硅膠會(huì)釋出
生成絮狀物堵塞柱子,且難以復(fù)原,柱效很快降低,甚至*失效。
鹽類析出:當(dāng)在流動(dòng)相緩沖液中加入和水混溶的有機(jī)溶劑時(shí),其中的鹽類溶解度下降,可析出鹽類沉淀,堵塞柱子;加入粘度不同的樣品溶液也可能發(fā)生類似現(xiàn)象。所以緩沖液中鹽的濃度宜低,樣品提取液的組成應(yīng)和流動(dòng)相匹配。
2 樣品對(duì)色譜柱的損害因素
雜質(zhì)堵塞:樣品中的微粒同樣會(huì)使柱子堵塞,樣品也應(yīng)進(jìn)行過濾處理。
樣品組分的不可逆吸附:通常被吸附的組分有蛋白質(zhì)、醣等,可以采取加裝保護(hù)柱,或使用適應(yīng)的溶劑反沖來處理。常用溶劑有四氫呋喃（適用于溶解有機(jī)高聚物和工業(yè)樣品中的焦油）、高濃度的脲或鹽酸胍溶液（使蛋白質(zhì)改性而洗脫）、高離子強(qiáng)度的磷酸鹽緩沖液（pH=7,適合反相柱和離子交換柱,可除去蛋白質(zhì)和醣等）。
樣品組分與固定相反應(yīng):這種反應(yīng)對(duì)NH2柱的影響較嚴(yán)重,NH2易和酐、酮形成希夫（Schiff）縮合而減少活性點(diǎn),使保留時(shí)間縮短,因此羰基化合物樣品和流動(dòng)相（如丙酮、乙酸乙酯等）不宜使用NH2柱。
活性點(diǎn)被覆蓋:由于固定相吸附樣品中的組成或雜質(zhì)而使活性點(diǎn)被覆蓋,在柱壓升高的同時(shí)保留時(shí)間減少,將樣品過濾或使用萃取分離柱（對(duì)大分子有機(jī)物如蛋白質(zhì)、白細(xì)胞等）效果較好。
3、色譜柱固定相的化學(xué)變化
色譜柱固定相分解、活性基團(tuán)變性以及鍵合相基團(tuán)脫落會(huì)使保留時(shí)間顯著變化。
3.1 鍵合相基團(tuán)脫落
絕大多數(shù)鍵合相都是通過硅氧硅鍵（Si-O-Si）連接在硅基質(zhì)上,形成帶有機(jī)基團(tuán)的固定相Si-O-Si-R（R為G18H37、C8H17、CnH2n+1）。硅氧硅鍵可在水溶液中水解而斷裂,使鍵合相基團(tuán)脫落,對(duì)C2和NH2柱鍵合相基團(tuán)脫落不可忽視。為減少或防止基團(tuán)脫落,可增加流動(dòng)相的有機(jī)溶劑量,降低離子強(qiáng)度和pH值,對(duì)基團(tuán)已脫落的固定相,可用合適的硅烷試劑再生。
3.2 固定相分解或活性基團(tuán)變性
例如氰基柱的保留時(shí)間顯著縮短,但鍵合相中C、H、N的百分含量并無大變化,證明未發(fā)生—CN水解成-COOH反應(yīng),而是形成了衍生物。在硅上增加烷基可減少水解。
4、液相色譜柱的保養(yǎng)
色譜柱在使用一段時(shí)間后,常遇到柱子受污染,柱效下降的問題,采用適當(dāng)?shù)姆椒▽?duì)色譜加以保護(hù)和再生,能夠延長色譜柱的使用壽命。
使用保護(hù)柱和過濾樣品、流動(dòng)相:流動(dòng)相中若有不純物聚積存柱頂,將影響柱壽命,所以溶劑應(yīng)使用HPLC級(jí)的,樣品和流動(dòng)相用前先以微孔薄膜過濾。對(duì)于較昂貴的色譜柱,可以在柱前加一個(gè)保護(hù)柱,防止樣品中雜質(zhì)污染分析柱,對(duì)于制備柱,因其進(jìn)樣量大,使用保護(hù)柱尤為重要。
已污染柱的處理:因保留強(qiáng)的物質(zhì)污染,柱頂或樣品中不溶物沉積于柱頂,可用下列方法洗滌1）去除脂類可用四氫呋喃乙腈或甲醇洗滌;（2）去除蛋白質(zhì)可用乙腈,丙醇和1%三氯乙酸進(jìn)行梯度洗脫;（3）某些高疏水性化合物,可用乙腈或甲醇洗脫,同時(shí)反復(fù)注入四氫呋喃（100-200）ml。
對(duì)于使用一段時(shí)間后柱效下降的色譜柱可按下列方法進(jìn)行再生。再生處理包括活化（右→左）和凈化（左→右）兩種。（1）硅膠、氧化鋁和極性（正相）鍵合相色譜柱按下列順序依次沖冼:*基戍烷或已烷→三氯乙烷→乙酸乙酯→丙酮→乙醇→水。（2）鍵合相硅膠柱:苯基、氰基鍵合相柱按以下順序沖洗:蒸餾水→甲醇（沖洗過程中可加入少量二甲基甲酰胺）→分離樣品用的流動(dòng)相。（3）陰、陽離子交換柱:酸性有機(jī)物吸附在固定相表面的用低pH緩沖液沖洗,堿性有機(jī)物用高pH緩沖液沖洗,然后依次用蒸餾水→甲醇→二氯甲烷→甲醇→蒸餾水沖洗干凈。
柱頭處理:對(duì)于柱頂堵塞、嚴(yán)重污染,用溶劑沖洗無效的色譜柱,只有打開柱子去掉柱頂?shù)奶盍现靥?先拆下不銹鋼燒結(jié)過濾器,檢查柱床,常見塌陷或受污染的帶色填料,剔掉無規(guī)則床層和帶色填料,使柱床顯白色并*水平,再用甲醇作糊狀填料勻漿液,將糊狀填料勻漿液滴在柱上靠重力從勻漿液中排出甲醇液,重復(fù)直到填料水平。
柱子的貯存:柱子不能貯存于水或水性溶劑中,否則會(huì)引起細(xì)菌在柱中生長或產(chǎn)生鹽類沉淀。貯存前應(yīng)先用適當(dāng)?shù)娜軇ㄈ缂状迹?將柱子沖洗干凈,再將柱子兩頭密封,以防溶劑蒸發(fā)使柱子干燥而引起柱子結(jié)構(gòu)的幾何學(xué)改變。
液相色譜柱的選擇
一、硅膠基質(zhì)填料
　　1、正相色譜 正相色譜用的固定相通常為硅膠（Silica）以及其他具有極性官能團(tuán)胺基團(tuán)，如（NH2，APS）和氰基團(tuán)（CN，CPS）的鍵合相填料。
　　由于硅膠表面的硅羥基（SiOH）或其他極性基團(tuán)極性較強(qiáng)，因此，分離的次序是依據(jù)樣品中各組分的極性大小，即極性較弱的組份zui先被沖洗出色譜柱。正相色譜使用的流動(dòng)相極性相對(duì)比固定相低，如正已烷（Hexane），氯仿（Chloroform），二氯甲烷（Methylene Chloride）等。
　　2、反向色譜 反向色譜用的填料常是以硅膠為基質(zhì)，表面鍵合有極性相對(duì)較弱官能團(tuán)的鍵合相。反向色譜所使用的流動(dòng)相極性較強(qiáng)，通常為水、緩沖液與甲醇、乙腈等的混合物。樣品流出色譜柱的順序是極性較強(qiáng)的組分zui先被沖洗出，而極性弱的組分會(huì)在色譜柱上有 強(qiáng)的保留。
　　常用的反向填料有：C18（ODS）、C8（MOS）、C4（Butyl）、C6H5（Phenyl）等。
　　二、聚合物填料 聚合物填料多為聚苯乙烯—二乙烯基苯或聚甲基丙烯酸脂等，其重要優(yōu)點(diǎn)是在PH值為1—14均可使用。相對(duì)于硅膠基質(zhì)的C18填料， 類填料具有更強(qiáng)的疏水性；大孔的聚合物對(duì)蛋白質(zhì)等樣品的分離非常有效?，F(xiàn)有的聚合物填料的缺點(diǎn)是相對(duì)硅膠基質(zhì)填料，色譜柱柱效較低。
　　三、其它無機(jī)填料 其它HPLC的無機(jī)填料色譜柱也已經(jīng)商品化由于其特殊的性質(zhì)，一般于特殊的用途。如，石墨化碳黑正逐漸成為反向色譜柱填料。這種填料的分離不同于硅膠基質(zhì)烷基鍵合相，石墨化碳的表面即是保留的基礎(chǔ)，不再需其它的表面改性。該柱填料一般比烷基鍵合相硅膠或多孔聚合物填料的保留能力更強(qiáng)。石墨化碳可用于分離某些幾何異構(gòu)體，由于在HPLC流動(dòng)相中不會(huì)被溶解，這類柱可在任何PH與溫度下使用。氧化鋁也可以用于HPLC。氧化鋁微粒剛性強(qiáng)，可制成穩(wěn)定的色譜柱柱床，其優(yōu)點(diǎn)是可以在PH高達(dá)12的流動(dòng)相中使用。但由于氧化鋁與堿性化合物的作用也很強(qiáng)，應(yīng)用范圍受到一定限制，所以未能廣泛應(yīng)用。新型色譜氧化鋯基質(zhì)填料也可用于HPLC。商品化的只有聚合物涂層的多孔氧化鋯微球色譜柱，應(yīng)用PH1-14，溫度可達(dá)100℃。由于氧化鋯填料是zui近幾年才開始研究，加之面臨的實(shí)驗(yàn)難度，其重要用途與優(yōu)勢(shì)尚在進(jìn)行之中。
　　怎樣選擇填料粒度  ，商品化的色譜填料粒度從1um到超過30um均有銷售，而目前分析分離主要用3和5um填料進(jìn)行。填料的粒度主要影響填充柱的兩 參數(shù)，即柱效和背壓。粒度越小，柱壓越大，柱壓的增加限制了粒度小于3um的填料應(yīng)用。在相同選擇性條件下，提高柱效可提高分離度，但不是*的因素。如果固定相選擇是正確，但是分離度不夠，那么選用更小的粒度的填料是很有用的。3um填料填充柱的柱效比相同條件下的5um填料的柱效提高近30%；然而，3um的色譜柱的背壓卻是5um的2倍。與此同時(shí)，柱效提高意味著在相同條件下可以選用更短的色譜柱，即相同的塔板數(shù)或分離能力，但是柱長更短，以縮短分析時(shí)間。另外，可以采用低粘度的溶劑做流動(dòng)相或增加色譜柱的使用溫度，比如用乙腈代替甲醇，以降低色譜柱的壓力。
柱子的極性取決于固定相的極性
我們常用柱子的極性如下:
一、非極性
1、100%Dimethyl polysiloxane，100%聚二甲基硅氧烷，商品名：AC1，OV-101，OV-1，DB-1，SE-30，HP-1，RTX-1，BP-1
二、弱極性
2、5%Phenyl dimethyl polysiloxane, 5%二苯基（95%）二甲基聚硅氧烷，商品名：AC5，SE-52，
3、5% Phenyl 1%vinyl dimethyl polysiloxane，5%二苯基1%乙烯基（94%）二甲基聚硅氧烷，商品名：OV-5，DB-5，SE-54，HP-5，RTX-5，BP-5
注：2、3常無嚴(yán)格區(qū)分，通?；旆Q。
三、中等極性
4、50%Phenyl dimethyl polysiloxane, 50%二苯基（50%）二甲基聚硅氧烷，商品名：OV-17，HP-50，RTX-50
5、14%Cyanopropyl phenyl polysiloxane, 14%氰丙基苯基（其中7%氰丙基7%苯基）（86%）二甲基聚硅氧烷，商品名：AC10，OV-1701，DB-1701，RTX-1701
6、50% Cyanopropyl phenyl polysiloxane，50%氰丙基苯基（其中25%氰丙基25%苯基）（50%）二甲基聚硅氧烷，商品名：AC225，OV-225，BP-225，DB-225，HP-225，RTX-225
四、強(qiáng)極性
7、polyethylene glycol,聚乙二醇，商品名：AC20，PEG20M，HP-INNOWAX（FFAP是其與2-硝基對(duì)苯二甲酸的反應(yīng)產(chǎn)物）
使用范圍 反相柱優(yōu)點(diǎn)是固定相穩(wěn)定，應(yīng)用廣泛，可使用多種溶劑。但硅膠為基質(zhì)的填料，使用時(shí)一定要注意流動(dòng)相的PH范圍。一般的C18柱PH值范圍都在2-8，流動(dòng)相的PH值小于2時(shí)，會(huì)導(dǎo)致鍵合相的水解；當(dāng)PH值大于7時(shí)硅膠易溶解；經(jīng)常使用緩沖液固定相要降解。一旦發(fā)生上述情況，色譜柱人口處會(huì)塌陷。同樣填料各種不同牌號(hào)的色譜柱不盡相同。如果流動(dòng)相PH較高或經(jīng)常使用緩沖液時(shí)，建議選擇PH范圍大的柱子，例如戴安公司的Acclaim柱PH 2-9或Zorbax的PH 2-11. 5的柱子。 2．填料的端基封尾（或稱封口） 把填料的殘余硅羥基采用封口技術(shù)進(jìn)行端基封尾，可改善對(duì)極性化合物的吸附或拖尾；含碳量增高了，有利于不易保留化合物的分離；填料穩(wěn)定性好了，組分的保留時(shí)間重現(xiàn)性就好。如果待分析的樣品屬酸性或堿性的化合物，選用填料經(jīng)端基封尾的色譜柱。 3．戴安公司Acclaim柱子介紹—極性封尾C16固定相柱 戴安公司有28種類型的柱子，Acclaim反相柱填料高純，金屬含量極低，*封尾。PH 2-9范圍內(nèi)兼容，低流失，高柱效。尤其是2003年推出的Acclaim極性封尾C16柱，是zui先商品化的磺酰氨-O鏈接鍵的色譜柱，具極低的硅羥基活性，能在極性溶劑甚至100%水的條件下長期使用。對(duì)酸性和堿性化合物有極為尖銳的好的色譜峰形，與現(xiàn)有的*色譜柱相比有更好的立體選擇性。（下圖是 Acclaim極性封尾C16柱和市售極性封尾*色譜柱分離酸性化合物譜圖的比較） 二、液相色譜柱的使用 色譜柱在使用前，進(jìn)行柱的性能測(cè)試，并將結(jié)果保存起來，作為今后評(píng)價(jià)柱性能變化的參考。在做柱性能測(cè)試時(shí)要按照色譜柱出廠報(bào)告中的條件進(jìn)行（出廠測(cè)試所使用的條件是*條件），只有這樣，測(cè)得的結(jié)果才有可比性。但要注意：柱性能可能由于所使用的樣品、流動(dòng)相、柱溫等條件的差異而有所不同。 1、樣品的前處理 a、使用流動(dòng)相溶解樣品。 b、使用預(yù)處理柱除去樣品中的強(qiáng)極性或與柱填料產(chǎn)生不 可逆吸附的雜質(zhì)。 c、使用0.45—#181;m的過濾膜過濾除去微粒雜質(zhì)。 2、流動(dòng)相的配制 液相色譜是樣品組分在柱填料與流動(dòng)相之間質(zhì)量交換而達(dá)到分離的目的，因此要求流動(dòng)相具備以下的特點(diǎn)： a、流動(dòng)相對(duì)樣品具有一定的溶解能力，保證樣品組分不會(huì)沉淀在柱中（或長時(shí)間保留在柱中）。 b、流動(dòng)相與樣品不產(chǎn)生化學(xué)反應(yīng) c、流動(dòng)相的黏度要盡量小，以便得到好的分離效果；降低柱壓降，延長泵的使用壽命（可運(yùn)用提高溫度的方法降低流動(dòng)相的黏度）。 d、流動(dòng)相的物化性質(zhì)要與使用的檢測(cè)器相適應(yīng)。如使用UV檢測(cè)器，使用對(duì)紫外吸收較低的溶劑配制。 e、流動(dòng)相沸點(diǎn)不要太低，否則容易產(chǎn)生氣泡，導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)無法進(jìn)行。 f、在流動(dòng)相配制好后，一定要進(jìn)行脫氣。除去溶解在流動(dòng)相中的微量氣體既有利于檢測(cè)，還可以防止流動(dòng)相中的微量氧與樣品發(fā)生作用。 3、流動(dòng)相流速的選擇 因柱效是柱中流動(dòng)相線性流速的函數(shù)，使用不同的流速可得到不同的柱效。對(duì)于一根特定的色譜柱，要追求*柱效，使用*流速。對(duì)內(nèi)徑為4.6mm的色譜柱，流速一般選擇1ml／min，對(duì)于內(nèi)徑為4.0mm柱，流速0.8ml／min為佳。 當(dāng)選用*流速時(shí)，分析時(shí)間可能延長?？刹捎酶淖兞鲃?dòng)相的洗滌強(qiáng)度的方法以縮短分析時(shí)間（如使用反相柱時(shí)，可適當(dāng)增加甲醇或乙腈的含量）。 注意： a．含水流動(dòng)相在實(shí)驗(yàn)前配制，尤其是夏天使用緩沖 溶液作為流動(dòng)相不要過夜。加入*，防止細(xì)菌生長。 b．流動(dòng)相要求使用0.45 —#181;m濾膜過濾，除去微粒雜質(zhì)。 c．使用HPLC級(jí)溶劑配制流動(dòng)相，使用合適的流動(dòng)相可延長色譜柱的使用壽命，提高柱性能。 三． 色譜柱的維護(hù) 1. 色譜柱的平衡 反相色譜柱由工廠測(cè)試后是保存在乙腈/水中的。新柱應(yīng)先使用10－20倍柱體積的甲醇或乙腈沖洗色譜柱。請(qǐng)一定確保您分析樣品所使用的流動(dòng)相和乙腈/水互溶。 每天用足夠的時(shí)間以流動(dòng)相來平衡色譜柱，您就會(huì)在處理問題方面獲得zui大的"補(bǔ)償"，而且您的色譜柱的壽命也會(huì)變得更長！操作步驟： a. 平衡開始時(shí)將流速緩慢地提高，用流動(dòng)相平衡色譜柱直到獲得穩(wěn)定的基線（緩沖鹽或離子對(duì)試劑流速如果較低，則需要較長的時(shí)間來平衡） b. 如果使用的流動(dòng)相中含有緩沖鹽，應(yīng)注意用純水"過渡"即每天分析開始前必須先用純水沖洗30分鐘以上再用緩沖鹽流動(dòng)相平衡； 分析結(jié)束后必須先用純水沖洗30分鐘以上除去緩沖鹽之后再用甲醇沖洗30分鐘保護(hù)柱子。 2． 色譜柱的再生 長期使用的色譜柱，往往柱效會(huì)下降（柱子的理論塔板數(shù)減低）。可以對(duì)色譜柱進(jìn)行再生，在有條件的實(shí)驗(yàn)室應(yīng)使用一個(gè)廉價(jià)的泵進(jìn)行柱子的再生?！?建議用來沖洗柱子的溶劑體積 色譜柱尺寸 柱體積 所用溶劑的體積 125-4mm 1.6ml 30ml 250-4 mm 3.2ml 60ml 250-10mm 20ml 400ml 選擇再生方法： 極性固定相（如Si，NH2* ，DIOL基色譜填料）的再生： 正庚烷→氯仿→乙酸乙酯→丙酮→乙醇→水** 非極性固定相（如反相色譜填料RP－18，RP－8，CN等）的再生： 水→乙腈→氯仿（或異丙醇）→乙腈→水 注意： a. 在對(duì)NH2改性的色譜柱進(jìn)行再生時(shí)，由于NH2可能以銨根離子的形式存在，因此應(yīng)該在水洗后用0.1M的氨水沖洗，然后再用水沖洗至堿溶液*流出。 b. 0.05M稀硫酸可以用來清洗已污染的色譜柱，如果簡單的用有機(jī)溶劑/水的處理不能夠*洗去硅膠表面吸附的雜質(zhì)，在水洗后加用0.05M稀硫酸沖洗非常有效。 3. 色譜柱的維護(hù) a．使用預(yù)柱保護(hù)分析柱（硅膠在極性流動(dòng)相/離子性流動(dòng)相中有一定的溶解度） b．大多數(shù)反相色譜柱的pH穩(wěn)定范圍是2－7.5，盡量不超過該色譜柱的pH范圍 c．避免流動(dòng)相組成及極性的劇烈變化 d．流動(dòng)相使用前必須經(jīng)脫氣和過濾處理 e．如果使用極性或離子性的緩沖溶液作流動(dòng)相，應(yīng)在實(shí)驗(yàn)完畢柱子沖洗干凈，并保存于甲醇或乙腈中 f．氯化物的溶劑對(duì)其有一定的腐蝕性，故使用時(shí)要注意，柱及連接管內(nèi)不能長時(shí)間存留此類溶劑，以避免腐蝕。